Prehistoryczna szkoła przetrwania wyzwaniem dla współczesnej medycyny (czyli biofilm bakteryjny na przykładzie Pseudomonas aeruginosa)

Ziemia powstała 4,5 miliarda lat temu, a już od 3,8 miliarda lat obecne jest na niej życie bakteryjne (Procaryota). Starożytne gatunki bakterii przeżywały i adaptowały się do najbardziej nieprzyjaznych warunków otoczenia. Zmieniły atmosferę, produkując tlen 2,5 miliarda lat temu, oraz powierzchnię Ziemi tworząc sedymenty soli żelaza. Eucariota (Protozoa) rozwinęły się 2 miliardy lat temu, ale dopiero w okresie kambru, ok. 600 milionów lat temu rozwinęło się życie wielokomórkowe (rośliny i zwierzęta). Największe zagłady organizmów wielokomórkowych zdarzyły się 5-krotnie, podczas ostatniej wymarły dinozaury. Jednak bakterie zawsze przeżywały, adaptując się do nowych warunków otoczenia łącznie z powierzchnią wewnętrzną i zewnętrzną organizmów wielokomórkowych. Kiedy ok. 150 tys. lat temu w Afryce pojawił się współczesny człowiek i podbijał Europę 40 tysięcy lat temu, przenosił na sobie bakterie.

Wyjątkowa zdolność do przeżycia i trwania w nieprzyjaznych warunkach otoczenia to zjawisko rozprzestrzenione wśród bakterii. Nazywana jest sessile way of growth i charakteryzuje się tworzeniem biofilmu.

Biofilm – charakterystyka

Jeszcze nie tak dawno mikrobiolodzy medyczni uważali bakterie izolowane z organizmów ludzkich i zwierzęcych za formy planktoniczne, czasami tworzące klastery czy łańcuchy. Jednak mikrobiolodzy badający bakterie ze środowiska od dawna wiedzieli, że większość bakterii w naturze przylega do powierzchni, tworząc na niej biofilm. Biofilmy bakteryjne istniały już 3,8 miliarda lat temu, kiedy powstało życie na Ziemi, i skamieliny (stomatolithes) mat bakteryjnych znajdowane są w sedymentach z ery prekambryjskiej, np. w Australii. Biofilmy bakteryjne składają się z mikrokolonii otoczonych wielocukrem produkowanym przez bakterie, stanowiące około 20% objętości. Powstaje gradient 1 tlenowy, głębsze warstwy są anaerobowe 2. Biofilm ma zmienną grubość. Szybkość wzrostu bakterii w biofilmie jest zredukowana w porównaniu do form planktonicznych, aktywność poszczególnych komórek koordynują substancje chemiczne, jak w komórkach eukariotycznych. Aktywność metaboliczna bakterii może niszczyć powierzchnię, na której się znajdują, np. powierzchnię metalu, zębów (skorodowany metal, próchnica), blokować wąskie przewody, blokować wymianę ciepła w klimatyzacjach. Bakterie tworzące biofilmy stanowią istotne zanieczyszczenie basenów, jacuzzi, chłodzącej wody w sprzęcie dentystycznym. Biofilmy są dynamiczną masą bakteryjną cieszącą się przywilejami życia wielokomórkowego. Proporcja rezerwuaru bakteryjnego biofilmu i planktonicznych komórek „córek” zależy od warunków otoczenia, np. w organizmie ludzkim pod wpływem niespecyficznych i specyficznych mechanizmów obronnych i obecności antybiotyków.

Tworzenie biofilmu – adhezja

Przyleganie bakterii do powierzchni jest odwracalne w ciągu kilku pierwszych godzin. Potem staje się nieodwracalne z powodu udziału pili i glikokaliksu bakterii. Bakterie mogą metabolizować organiczne cząsteczki powierzchni. Następuje aktywacja genów odpowiedzialnych za adhezję oraz reagujących na zmiany środowiska, co prowadzi do produkcji wielocukrów i skonsolidowanej adhezji 3. Rosnący biofilm składa się z wielu warstw komórek i ma nierówną powierzchnię, która powoduje turbulencje przepływającego płynu i oderwanie komórek „córek” zasiedlających kolejne miejsca. Uwalnianie komórek „córek” jest synchronizowane, mają one większą hydrofilność.

Biofilm i antybiotyki

Bakterie rosnące w formie biofilmu charakteryzuje dużo większa oporność na antybiotyki i środki dezynfekcyjne w porównaniu do form planktonicznych (już około 1000 razy większa w 7-dniowym biofilmie w porównaniu do jednodniowego). Czynniki większej oporności biofilmu to: wolniejszy wzrost (dłuższy czas ekspozycji), beztlenowe warunki „na dnie” biofilmu, bariera śluzowa, obecność enzymów (beta-laktamazy), właściwości powierzchni.

Powoduje to brak eradykacji 4, pomimo laboratoryjnych badań wskazujących na wrażliwość, która dotyczy tylko form planktonicznych! Z drugiej strony następuje na ogół poprawa kliniczna pacjenta i funkcji jego płuc oraz zmniejszenie ilości (gęstości) planktonicznych form w plwocinie. Tradycyjne techniki diagnostyki mikrobiologicznej informują nas tylko o wrażliwości na antybiotyki komórek planktonicznych, a nie biofilmu! (Trzeba byłoby go wyprodukować i dopiero na modelu biofilmu testować wrażliwość na antybiotyki).

Istotną sprawą w patogenności pałeczek Pseudomonas aeruginosa (P.a., pałeczki ropy błękitnej) jest właśnie wzrost w postaci biofilmu (city of microbes). Dotyczy to także wzrostu ich oporności na antybiotyki i środki odkażające, jak również na elementy układu odpornościowego. Zasadniczo uważa się, że komórki występujące w formie biofilmu mogą być 1000 razy bardziej odporne na antybiotyk, aniżeli ten sam drobnoustrój namnażający się w formie planktonicznej. Właściwość bakterii do syntezy biofilmu uważana jest za bardzo istotny element wirulencji5, ważny w patogenezie.

Na podstawie badań plwociny chorych z CF wiadomo, wbrew wcześniejszym sugestiom, że P.a. nie są „uśpione” metabolicznie. Dzielą się dość szybko. Wydzielane przez nie elementy zjadliwości prowadzą do destrukcji tkanek gospodarza (wydzielanie aktywnych proteaz, lipazy i piowerdyny) oraz stymulacji odpowiedzi zapalnej.

Charakterystyka Pseudomonas aeruginosa

Występowanie

Pałeczki z rodzaju Pseudomonas są drobnoustrojami bardzo rozpowszechnionymi w przyrodzie. Występują w glebie, wodzie słodkiej i morskiej, ściekach, powietrzu i na roślinach.

Mogą być obecne w wydzielinach i wydalinach, jak: ropie, płynie wysiękowym, plwocinie, moczu, kale, próbkach tkanek z biopsji. Spotykane są także jako zanieczyszczenie leków i materiałów medycznych.

Hodowla

Rodzaj Pseudomonas to tlenowe, Gram-ujemne pałeczki. Prawie połowa gatunków tego rodzaju wytwarza fluoryzujące lub niefluoryzujące barwniki. P.a. wydzielają charakterystyczny zapach miodu lub jaśminu, właściwy dla trietyloaminy. Na podłożach zwykłych bakteria ta rośnie w postaci dużych, błyszczących, brązowo-żółtych kolonii. Otoczenie kolonii zabarwione jest zazwyczaj na kolor zielonożółty lub zielononiebieski.

Budowa

LPS – lipopolisacharyd błony zewnętrznej odgrywa rolę w reakcjach serologicznych, wrażliwości na bakteriofagi, piocyny i antybiotyki oraz wpływa na fenotyp 6 bakterii. Jest także receptorem dla przeciwciał i dopełniacza7. Śluz wytwarzany przez P.a., dzięki fizykochemicznemu podobieństwu do wielocukrów LPS, reaguje z dopełniaczem i przeciwciałami, nie dopuszczając ich do wrażliwej powierzchni komórki. Fizykochemiczne właściwości śluzu bakteryjnego są podobne do właściwości żywic jonowymiennych. Redukuje on ilość naładowanych cząsteczek, w tym również antybiotyków, które przechodzą przez niego w kierunku osłony komórkowej. Sprzyja adhezji bakteria–bakteria i bakteria–tkanka, ułatwiając w ten sposób tworzenie w tkankach mikrokolonii opornych na fagocytozę.

Pałeczki Pseudomonas aeruginosa szybko tracą wrażliwość na większość stosowanych powszechnie środków dezynfekcyjnych, co więcej – mogą je wykorzystywać do budowy własnych komórek jako źródło węgla (preparaty na bazie heksachlorofenu) i azotu (czwartorzędowe związki amoniowe). Dlatego konieczne jest stosowanie się do zalecanych dawek i stężeń podawanych przez producentów. Przykłady środków na bazie chloru to: Medicarina, Domestos, Acti-chlor; na bazie alkoholu to np. Incidin liquid spray. Pałeczki Pseudomonas rozkładają związki ropopochodne, tworzywa sztuczne oraz mają znaczny udział w procesach biodegradacji innych związków organicznych zanieczyszczających środowisko, takich jak: kwasy tłuszczowe, pestycydy. Są wrażliwe na wysuszenie i niskie pH (kwaśne).

Tak więc mikroorganizmy te po odpowiednim przygotowaniu i podaniu ograniczają wpływ substancji powodujących skażenie wód gruntowych, ziemi uprawnej i otwartych zbiorników wodnych; tym samym mogą eliminować następstwa oddziaływania tych substancji, często bardzo toksycznych i niekiedy kancerogennych dla zwierząt i człowieka.

Chorobotwórczość

Toksyczność oraz inwazyjność tych bakterii związana jest z następującymi czynnikami: letalną egzotoksyną A, endotoksyną (lipopolisacharydem – LPS), leukocydyną, enterotoksyną, enzymami proteolitycznymi – kolagenazą i elastazą, hemolizynami i zewnątrzkomórkowym śluzem. Za zjawisko adhezji i kolonizacji P.a. odpowiedzialne są swoiste dla tego gatunku fimbrie adhezyjne.

Pałeczka ropy błękitnej jako oportunista

Wywołuje infekcje u organizmów ludzkich i zwierzęcych z obniżoną odpornością. Jest istotnym czynnikiem zakażeń szpitalnych: od kolonizacji błon śluzowych do posocznicy.

Stanowi przyczynę ciężkich powikłań oparzeń i ran pooperacyjnych. Ponadto może powodować: infekcje układu oddechowego, dróg moczowych, oczu, skóry, zakażenia płodów, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (głównie noworodków), zapalenie ucha środkowego i zewnętrznego, kości kończyn. Może być także przyczyną zatruć pokarmowych jako następstwo zanieczyszczenia żywności, głównie mleka i jego przetworów.

Wśród zwierząt największą podatność na zakażenia obserwuje się u: bydła, świń, koni, kóz i owiec. Dotyczy to głównie zwierząt, które były nieprawidłowo żywione i/lub długo leczone antybiotykami, bądź też osobników o obniżonej odporności. Najczęstsze schorzenia to: mastitis i endometritis u bydła, otitis externa u psów i kotów, zapalenie gałki ocznej u owiec, zamieranie zarodków kurzych, zamieranie piskląt indyczych. Inseminacja nasieniem zanieczyszczonym P.a. może wywołać stany zapalne narządów rodnych loch, zakażenie noworodków u świń.

Odnotowano, że P.a. może także wywołać infekcje u roślin. Do najbardziej wrażliwych na zakażenie należą: wśród warzyw – seler, pomidor, cykoria, marchew, ogórek, zielona sałata, spośród kwiatów – aster, fiołek afrykański, azalia, petunia, begonia, chryzantema.

Ponadto P. tabaci powoduje choroby tytoniu, P. phaseolicola – fasoli, P. syringae –kukurydzy i pszenicy.

Mukowiscydoza (cystic fibrosis – CF)

Mikrobiologia i immunologia w CF

Pacjenci z CF nie mają wykrywalnego niedoboru odporności i poza układem oddechowym nie są bardziej podatni na infekcje niż zdrowe osoby w tym samym wieku i rzadko spotykana jest u nich bakteriemia 8. Nieprawidłową, gęstą, odwodnioną wydzielinę dróg oddechowych uważa się za przyczynę infekcji tego układu. Uruchomione zostają mechanizmy obronne. Przy braku eradykacji patogenu następuje niszczenie tkanki, m.in. z udziałem kompleksów immunologicznych.

Możliwa interwencja: nowe leki korygujące nieprawidłową wydzielinę (także rhDNaza) 9.

Synergizm pomiędzy infekcjami wirusowymi i Pseudomonas aeruginosa

Pacjenci z CF są bardzo podatni na wtórną kolonizację P.a. po infekcji wirusowej.

Interwencja: szczepienie przeciwko grypie.

Zakażenia bakteryjne

Bakterie są wciąż najważniejszymi mikroorganizmami odpowiedzialnymi za progresję choroby płuc i rokowanie w CF. Z uwagi na utajony charakter infekcji bakteryjnych w początkowej fazie, bardzo ważny jest ciągły monitoring flory bakteryjnej dolnych dróg oddechowych – regularne posiewy plwociny i wykonywanie antybiogramu.

Zasada: utrzymanie płuc chorego z CF bez przewleklej kolonizacji poprzez regularny monitoring bakteriologiczny oraz agresywną i wczesną antybiotykoterapię kolonizujących bakterii bez względu na to, czy są objawy kliniczne.

Pseudomonas aeruginosa w CF

Jednym z cięższych problemów powodowanych przez Pseudomonas aeruginosa jest jego zdolność do przewlekłej kolonizacji dróg oddechowych np. w CF (płuca, zatoki).

Przewlekła infekcja P.a. to endobronchiolitis wywołany bakteriami produkującymi biofilm, który sprawia, że są one oporne na antybiotyki i mechanizmy obronne organizmu.

Ciekawym spostrzeżeniem in vitro była doświadczalna kombinacja elektryczności i antybiotyku, która zabijała bakterie w biofilmie. Nieznany jest mechanizm tego zjawiska, ale możliwe wytłumaczenia to: elektroforeza, usunięcie kationów z matriksu 10 biofilmu, oksydacja, doprowadzająca do niszczenia ściany komórki bakteryjnej, w konsekwencji zwiększająca się przepuszczalność ściany komórki na antybiotyki. Inną doświadczalną opcją było stosowanie ultradźwięków w połączeniu z antybiotykami.

Na razie najistotniejsza jest jednak profilaktyka zakażeń i wczesna agresywna antybiotykoterapia, zanim biofilm zostanie ustabilizowany i zanim reakcja zapalna przez niego wywołana doprowadzi do zniszczenia tkanki.

Efekt submaksymalnych stężeń antybiotyków

Makrolidy: pomimo braku efektu bakteriostatycznego na P.a., poprawa następuje prawdopodobnie dzięki zahamowaniu produkcji białek, takich jak egzoproteaza, i interferencji z matriksem biofilmu. Ponadto występuje efekt hamowania funkcji granulocytów i wydzielania TNF-alfa przez monocyty.

Nabycie Pseudomonas aeruginosa

Istnieje, niestety, zarówno niebezpieczeństwo zakażeń krzyżowych pomiędzy pacjentami z CF, jak i możliwość nabycia szczepów ze środowiska (hydroterapia, urządzenia dentystyczne).

Izolacja pacjentów na oddziałach i w poradni.

Adhezja

P.a. wykazuje chemotaksję 11 do powierzchni bogatośluzowych. Pięć znanych czynników adhezji to: pile, alginat, hemaglutynina, egzoenzym S, flagella, które łączą się z odpowiednimi receptorami komórek gospodarza; uszkodzenie komórek nabłonka odkrywa nowe receptory.

Początek przewlekłej kolonizacji

Zazwyczaj przewlekłą kolonizację poprzedza okres 12 miesięcy przerywanej kolonizacji.

Czynniki sprzyjające przejściu w kolonizację przewlekłą to poza infekcją wirusową: toksyny produkowane przez P.a., takie jak np. elastaza i alkaliczna proteaza, które zakłócają fagocytozę i immunologicznie specyficzne mechanizmy obronne, a także LPS i alginat. W późniejszym okresie kolonizacji rola toksyn jest mniej istotna, bo powstają neutralizujące je przeciwciała.

Przewlekła kolonizacja

Najbardziej charakterystyczna cecha przewlekłej kolonizacji to produkcja śluzowego alginianu i tworzenie mikrokolonii w płucach chorego. Alginian jest polisacharydem i antygenem, który koreluje ze złą prognozą w CF. Wydaje się, że rodniki tlenowe produkowane w trakcie odpowiedzi zapalnej przez granulocyty indukują zmianę fenotypu P.a. na śluzowy.

LPS jest uważany za główny antygen kompleksów immunologicznych znajdowanych w plwocinie chorego z CF . Ilość przeciwciał produkowanych przez chorego narasta w czasie i rokuje niekorzystnie. Skierowane są one przeciwko niemal wszystkim znanym antygenom P.a. i należą do różnych klas immunoglobulin. Przewlekłe zapalenie toczy się z udziałem kompleksów immunologicznych, z aktywacją dopełniacza i intensywną lokalną produkcją cytokin prozapalnych: TNF, IL-1, -6, -8. Reakcja zdominowana jest przez granulocyty i uwolnione proteazy, mieloperoksydazy i rodniki tlenowe, prowadzi do uszkodzenia tkanki.

Na powstanie chronicznej infekcji P.a. składa się szereg mechanizmów adaptacyjnych, obejmujących: indukcję wzrostu w postaci biofilmu, zmianę ekspresji genów wirulencji, selekcję mutacji adaptacyjnych potrzebnych do długiego bytowania (odpowiadających za wzrost antybiotykooporności, adaptację wirulencji, czyli obniżenie ostrego, ale zwiększenie chronicznego zapalenia, adaptację metaboliczną do wzrostu w warunkach mikroaerobowych, spowodowanych ropną wydzieliną; składa się na to ok. 68 mutacji powstających podczas ustalania przewlekłej kolonizacji).

Leczenie przeciwzapalne

Leczenie inhibitorami proteaz (w trakcie badań klinicznych).

Antybiotykoterapia początkowej kolonizacji

Antybiotykoterapia wziewna.

Ciprofloksacynę – doustnie.

Antybiotyki dożylne.

Antybiotykoterapia przewlekłej kolonizacji

Mechanizm działania antybiotyków w kolonizacji P.a.

Masa biofilmu może być zmniejszona nawet o ok. 20% przez duże dawki skojarzonych antybiotyków. Efekt przeciwzapalny podprogowych stężeń antybiotyków (makrolidy) hamuje produkcję proteaz, fosfolipazy i alginianu, zmniejszając obciążenie antygenowe i produkcję kompleksów. Znajduje to wyraz w normalizacji markerów zapalnych (leukocytoza, CRP) po kuracji antybiotykami.

Skuteczność leczenia

Niestety, na dzień dzisiejszy nie ma możliwości całkowitej eradykacji przewlekłej kolonizacji P.a. Istnieje jedynie szansa spowolnienia postępu uszkodzenia tkanki płucnej.

Problem stanowi rozwój oporności na antybiotyki. Lekooporne szczepy powstają na drodze mutacji i przenoszenia materiału genetycznego (plazmid R).

Nie powiodły się dotychczas próby walki za pomocą immunoterapii. Dotychczas wyprodukowane szczepionki przeciwko Pseudomonas aeruginosa okazywały się, niestety, za mało skuteczne.

Zadania na przyszłość

  • Profilaktyka – izolacja chorych.
  • Agresywne leczenie początkowej kolonizacji.
  • Trwa także intensywne poszukiwanie nowych form i klas antybiotyków.
  • Ważna jest poprawa farmakodynamiki (nowe formy antybiotyków) i opracowanie skuteczniejszych metod podawania.
  • Leczenie przeciwzapalne.
  • Niszczenie biofilmu.
  • Lekcja z natury: plechy krasnorostu Delisea pulchra rzadko są pokryte biofilmami, pomimo iż w wodach żyje tysiące gatunków bakterii. Wydzielają substancje chemiczne podobne do substancji sygnałowych.
  • Przerwanie komunikacji za pomocą blokady receptorów dla cząsteczek sygnałowych spowoduje brak ekspresji genów niezbędnych do tworzenia biofilmu.
  • Działanie antyadhezyjne: bardzo istotne metody w walce z biofilmem posiadają biosurfaktanty produkowane przez bakterie, kwas kapronowy produkowany przez Saccharomyces boulardi.

Istnieje ogromna dysproporcja czasu pracy bakterii i naukowców: 3,8 miliarda lat istnienia bakterii kontra około 30 lat pracy naukowców nad biofilmem, czyli perspektywa pracy dla dalszych pokoleń naukowców.

Na razie dojrzały biofilm jest nie do pokonania, więc największe nadzieje wiązane są z leczeniem przyczynowym mukowiscydozy – nowymi lekami, które znajdują się obecnie w trakcie badań klinicznych.

Bibliografia

  1. Janek T., Łukaszewicz M., Rezanka T. i wsp. Isolation and characterization of two new lipopeptide biosurfactants produced by Pseudomonas fluorescens BD5 isolated from water from the Arctic Archipelago of Svalbard. Bioresource Technology. 2010; 101: 6118–6123.
  2. Kosikowska U., Malm A. Biofilm in vivo – intrygujące wyzwanie dla nauki. Farmacja Polska 2004; 60: 291–297.
  3. Miller M., Bassler B. Quorum Sensing in Bacteria. Annual Review of Microbiology. 2001; 55: 165–199.
  4. Murzyn A., Krasowska A., Stefanowicz P. i wsp. Capric Acid Secreted by S. boulardii
    inhibits C. albicans Filamentous Growth, Adhesion and Biofilm Formation. PLoSONE. 2010; 5: e12050.
  5. Oinuma, K.I., Greenberg, E.P. Acyl-Homoserine Lactone Binding to and Stability of
    the Orphan Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signal Receptor QscR. 2011. J. Bacteriol. 193: 421–428.
  6. Strauss E. Mob action: Peer pressure in the bacterial world. 1997; 152: 124–125

Przypisy

  1. Warstwę zewnętrzną stanowią bakterie tlenowe (aerobowe).Przypis 1

  2. Czyli beztlenowe.Przypis 2

  3. Przyleganie, łączenie się powierzchni dwóch różnych – stałych lub ciekłych – ciał (faz) na skutek przyciągania międzycząsteczkowego.Przypis 3

  4. Usunięcie patogenu z organizmu.Przypis 4

  5. Inaczej „zjadliwość”, czyli zdolność wywoływania chorób.Przypis 5

  6. Zespół charakterystycznych cech organizmu, widoczny na zewnątrz.Przypis 6

  7. Zespół kilkudziesięciu białek obecnych w osoczu, spełniających ważną rolę w układzie obronnym organizmu.Przypis 7

  8. Obecność bakterii we krwi.Przypis 8

  9. Dornaza alfa.Przypis 9

  10. Matriks biofilmu – substancja spajająca kolonie bakterii.Przypis 10

  11. Reakcja ruchowa drobnych organizmów na określone bodźce chemiczne.Przypis 11

Autor:
Klinika Mukowiscydozy, Instytut Matki i Dziecka w Warszawie Centrum Leczenia Mukowiscydozy, SZP-ZOZ im. „Dzieci Warszawy” w Dziekanowie Leśnym

Popularne wpisy